Βοτρύτης – Ακτινίδιο: Πολλαπλή ανθεκτικότητα απομονώσεων του Botrytis cinerea σε μυκητοκτόνα διαφόρων χημικών ομάδων

Ο μύκητας Botrytis cinerea Pers.: Fr. (teleomorph: Botryotinia fuckeliana), αποτελεί το σημαντικότερο περιοριστικό παράγοντα, από φυτοπαθολογικής άποψης, της καλλιέργειας ακτινιδίου [Actinidia deliciosa (A. Chev.) CS Liang & AR Ferguson], προκαλώντας μετασυλλεκτικές απώλειες μεγαλύτερες του 20%, ενώ υπό συνθήκες ευνοϊκές για το παθογόνο οι απώλειες μπορεί να ξεπεράσουν και το 50% (1). Το συγκεκριμένο φυτοπαθογόνο χαρακτηρίζεται ως «υψηλού ρίσκου», ενώ υπάρχουν αναφορές ανθεκτικότητας απομονώσεων του σε ποικίλες ομάδες μυκητοκτόνων παγκοσμίως (2 - 4). Κατά τη διάρκεια των περιόδων αποθήκευσης ακτινιδίου παρατηρούνται ασυνήθιστα υψηλά ποσοστά προσβολών τεφράς σήψης σε ακτινίδια προερχόμενα από την περιοχή της Θεσσαλονίκης, αυξάνοντας τις ανησυχίες για πιθανή ύπαρξη ανθεκτικότητας στα χρησιμοποιούμενα φυτοπροστατευτικά σκευάσματα.

Η συγκεκριμένη ερευνητική προσπάθεια πραγματοποιήθηκε στοχεύοντας α) στον προσδιορισμό των επιπέδων ευπάθειας απομονώσεων του φυτοπαθογόνου στις δραστικές ουσίες boscalid και pyraclostrobin, οι οποίες χρησιμοποιήθηκαν εκτεταμένα κατά τις τρεις τελευταίες καλλιεργητικές περιόδους, (β) στον προσδιορισμό συχνοτήτων ανθεκτικότητας σε άλλες βοτρυδιοκτόνες δραστικές ουσίες (carbendazim, iprodione, fludioxonil, fenhexamid και cyprodinil) και (γ) στον έλεγχο παρουσίας μεταλλάξεων συνδεδεμένων με φαινόμενα ανθεκτικότητας στους αναστολείς  του κυτοχρώματος Qo (QoIs: μυκητοκτόνα της ομάδας των στρομπιλουρινών).

Υλικά – Μέθοδοι

Συλλογή φυτοπαθογόνων μυκήτων:

Οι απομονώσεις του B. cinerea συλλέχθηκαν από καρπούς, τριών γεωγραφικών περιοχών καλλιέργειας ακτινιδίου, με εμφανή συμπτώματα μετασυλλεκτικής σήψης. Πιο συγκεκριμένα 43 απομονώσεις προέρχονταν από την περιοχή της Θεσσαλονίκης, στην οποία εντοπιζόταν το πρόβλημα και την τελευταία τριετία χρησιμοποιήθηκαν εκτεταμένα τα boscalid και pyraclostrobin, ενώ 10 και 23 απομονώσεις συλλέχθηκαν από την περιοχή της Βέροιας και Κατερίνης αντίστοιχα. Στις συγκεκριμένες περιοχές η αντιμετώπιση του φυτοπαθόγονου στηριζόταν σε εφαρμογές μυκητοκτόνων ουσιών των ομάδων: anilinopyrimidines, dicarboxamides και benzimidazoles, ενώ δεν υπήρχε ιστορικό χρήσης των boscalid και pyraclostrobin.  

 Μετρήσεις ευπάθειας σε boscalid και pyraclostrobin

Η προμήθεια καθαρών τεχνικών προϊόντων boscalid και pyraclostrobin πραγματοποιήθηκε από την κατασκευάστρια εταιρία BASF Hellas (Athens, Greece). Για την παρασκευή διαλυμάτων εργασίας, η δραστική ουσία pyraclostrobin διαλύθηκε σε καθαρή ακετόνη ενώ η δραστική ουσία boscalid διαλύθηκε σε διμεθυλσουλφοξείδιο.

Οι μετρήσεις ευπάθειας στο pyraclostrobin βασίστηκαν στο ποσοστό αναστολής βλαστικότητας των κονιδίων του μύκητα (5), ενώ  η μέτρηση των επιπέδων ευπάθειας στο boscalid πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο των Stammler και Speakman (6).

Προσδιορισμός συχνοτήτων ανθεκτικότητας σε carbendazim, iprodione, fludioxonil, fenhexamid και cyprodinil

Ο προσδιορισμός των συχνοτήτων ανθεκτικότητας των απομονώσεων του μύκητα στις δραστικές ουσίες cyprodinil, carbendazim, fludioxonil, fenhexamid και iprodione βασίστηκε στη χρήση διαχωριστικών συγκεντρώσεων (οι ελάχιστες συγκεντρώσεις των δραστικών ουσιών που προκαλούσαν πλήρη αναστολή μυκηλιακής ανάπτυξης στις ευπαθείς απομονώσεις, ενώ επιτρέπουν την ανάπτυξη των ανθεκτικών απομονώσεων του μύκητα). Οι δοκιμές πραγματοποιήθηκαν με βάση τα εμπορικά σκευάσματα: του cyprodinil (Chorus 50 WG, Syngenta Hellas, Athens, Greece), του fenhexamid (Teldor 50 WG, Bayer Hellas, Athens, Greece), του fludioxonil (Medallion, 50 WP, Novartis Hellas, Athens, Greece), του iprodione (Rovral 50 WP, BASF Hellas) και του carbendazim (Pacarzim 50WP, Papaoikonomou Agrochemicals S.A., Thessaloniki, Greece).

Ταυτοποίηση της μετάλλαξης G143A

Για την ταυτοποίηση ύπαρξης της μετάλλαξης G143A, η οποία προσδίδει ανθεκτικότητα στους αναστολείς του κυτοχρώματος Qo (QoIs), πραγματοποιήθηκε η αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR) με χρήση του εξειδικευμένου ζεύγους εκκινητών BcAR-F και BcAR-R (3).

Επεξεργασία δεδομένων

Οι EC50 τιμές της κάθε απομόνωσης του μύκητα υπολογίστηκαν με βάση την αναστολή βλαστικότητας κονιδίων και με την αναστολή μυκηλιακής ανάπτυξης για pyraclostrobin και boscalid, αντίστοιχα, με τη βοήθεια του στατιστικού πακέτου SAS (JMP, SAS Institute, Cary, NC).

Αποτελέσματα

 Μετρήσεις ευπάθειας σε boscalid και pyraclostrobin

Με βάση την ευπάθεια στις δραστικές ουσίες boscalid και pyraclostrobin, οι απομονώσεις του B. cinerea κατηγοριοποιήθηκαν σε δύο ομάδες. Πιο συγκεκριμένα, μεταξύ των 76 απομονώσεων του μύκητα, 43 εμφάνισαν αυξημένα επίπεδα ανθεκτικότητας με τιμές EC50 μεγαλύτερες από 50 mg L-1 και από 16 έως >50 mg L-1, για boscalid και pyraclostrobin αντίστοιχα, με συντελεστές ανθεκτικότητας (Rf) >55 (boscalid) και από 400 έως >1250 (pyraclostrobin). Οι υπόλοιπες 33 απομονώσεις χαρακτηρίστηκαν ως ευπαθείς με τιμές EC50 μικρότερες του 5.2 mg L-1 και από 0.04 to 0.14 mg L-1, για boscalid και pyraclostrobin αντίστοιχα. Το σύνολο των ανθεκτικών απομονώσεων προερχόταν από οπωρώνες της περιοχής της Θεσσαλονίκης, με τριετές ιστορικό χρήσης των συγκεκριμένων δραστικών ουσιών, ενώ οι ευπαθείς απομονώσεις προέρχονταν από τις περιοχές Βέροιας και Κατερίνης, όπου δεν υπήρχε ιστορικό εφαρμογής των boscalid και pyraclostrobin.

Προσδιορισμός συχνοτήτων ανθεκτικότητας σε carbendazim, iprodione, fludioxonil, fenhexamid και cyprodinil

Ο προσδιορισμός των συχνοτήτων ανθεκτικότητας των απομονώσεων του μύκητα στις δραστικές ουσίες cyprodinil, carbendazim, fludioxonil, fenhexamid και iprodione κατηγοριοποίησε τις απομονώσεις του μύκητα σε έξι ομάδες, οι οποίες γίνονταν οκτώ με την ενσωμάτωση των αποτελεσμάτων ευπάθειας στα boscalid και pyraclostrobin. Πιο συγκεκριμένα μεταξύ των 76 απομονώσεων του φυτοπαθογόνου 14 ήταν ευπαθείς στο σύνολο των δραστικών ουσιών, 16 ήταν ανθεκτικές μόνο στο cyprodinil, 1 ήταν ταυτόχρονα ανθεκτική στο cyprodinil και στο carbendazim, 2 ήταν ανθεκτικές μόνο στο carbendazim, 3 ήταν ταυτόχρονα ανθεκτικές στα boscalid, pyraclostrobin, carbendazim και iprodione, 26 ήταν ταυτόχρονα ανθεκτικές στα boscalid, pyraclostrobin, cyprodinil και carbendazim, 4 ήταν ταυτόχρονα ανθεκτικές στα boscalid, pyraclostrobin, cyprodinil, carbendazim και iprodione. Τέλος, 10 απομονώσεις ήταν ταυτόχρονα ανθεκτικές στα boscalid, pyraclostrobin και carbendazim. Καμία από τις απομονώσεις που εξετάσθηκαν δεν εμφάνισε ανθεκτικότητα στα fludioxonil και fenhexamid.

Ταυτοποίηση της μετάλλαξης G143A

Το σύνολο των απομονώσεων του B. cinerea της συγκεκριμένης ερευνητικής προσπάθειας εξετάσθηκε με το εξειδικευμένο ζεύγος εκκινητών BcAR-F και BcAR-R, με αποτέλεσμα την εμφάνιση ζώνης μεγέθους 260bp αποκλειστικά και μόνο στις 43 ανθεκτικές στο pyraclostrobin απομονώσεις, υποδεικνύοντας την ύπαρξη της G143A μετάλλαξης.

Εικόνα 1. Κατανομή των συχνοτήτων τιμών EC50  απομονώσεων του Botrytis cinerea στο boscalid (A) και στο pyraclostrobin (B).

Εικόνα 2. Ταυτοποίηση ανθεκτικών στο pyraclostrobin απομονώσεων του B. cinerea με τη βοήθεια του εξειδικευμένου ζεύγους εκκινητών BcAR-F + BcAR-R.

Εικόνα 3.  Συχνότητα εμφάνισης ανθεκτικών φαινοτύπων απομονώσεων του Botrytis cinerea σε ανιλινοπυριμιδίνες(AniR), βενζιμιδαζόλια (BenR), καρβοξαμίδια (CarbR), αναστολείς του κυτοχρώματος Qo (QoIR) και δικαρβοξαμίδια (DicR).

Συμπεράσματα

Τα δεδομένα της συγκεκριμένης ερευνητικής προσπάθειας συνιστούν την πρώτη παγκόσμια αναφοράς ταυτόχρονης ανθεκτικότητας απομονώσεων αγρού του B. cinerea στις δραστικές ουσίες boscalid και pyraclostrobin, υποδεικνύοντας πιθανό επερχόμενο κίνδυνο σχετικά με την αντιμετώπιση του συγκεκριμένου φυτοπαθογόνου παράγοντα.

Η σημασία της συγκεκριμένης μελέτης επεκτείνεται και σε άλλες γεωργικές εκμεταλλεύσεις πέρα από αυτή του ακτινιδίου (σταφύλι, λαχανικά, φράουλα), στις οποίες γίνεται εκτεταμένη χρήση βοτρυδιοκτόνων.

Οι αποτυχίες αντιμετώπισης του B. cinerea εξαιτίας φαινομένων ανθεκτικότητας είναι σημαντικό ζήτημα για πληθώρα γεωργικών εκμεταλλεύσεων και απαιτείται η λήψη πρόσθετων μέτρων στρατηγικών αντιμετώπισης με σκοπό την αποφυγή επιλογής ανθεκτικών απομονώσεων του φυτοπαθογόνου.

         
ΚΑΤΕΥΘΥΝΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ ΦΥΤΟΠΡΟΣΤΑΤΕΥΤΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ - ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΕΣ ΥΠΗΡΕΣΙΕΣ

• Αντιμετώπιση φαινομένων ανθεκτικότητας,
• Απομόνωση φυτοπαθογόνων στόχων,
• Έλεγχος ευαισθησίας απομονώσεων φυτοπαθογόνων στόχων στο εργαστήριο στα διαθέσιμα – εγκεκριμένα μυκητοκτόνα,
• Καταγραφή αποτελεσματικών δραστικών κατά περίπτωση,
• Δημιουργία προγράμματος φυτοπροστασίας με βάση τις σωστές εναλλαγές και τις block εφαρμογές,¡        Μείωση κόστους – Αύξηση ποιότητας και ποσότητας παραγωγής,
• Οικολογικό πλεονέκτημα.

Βιβλιογραφία

1. Michailides TJ and Elmer PAG, Botrytis Gray Mold of Kiwifruit Caused by Botrytis cinerea in the United States and New Zealand. Plant Dis 84: 208 –223 (2000).
2. Baroffio CA, Siegfried W and Hilber UW, Long-term monitoring for resistance of Botrytis cinerea to anilinopyrimidine, phenylpyrrole, and hydroxyanilide fungicide in Switzerland. Plant Dis 87: 662–666 (2003).
3. Jiang J, Ding L., Michailides TJ, Li H and Ma Z, Molecular characterization of field azoxystrobin-resistant isolates of Botrytis cinerea, Pest Biochem and Physiol 93: 72-76 (2009).
4. Leroux P, Chapeland F, Desbrosses D and Gredt M, Patterns of cross-resistance to fungicides in Botryotinia fuckeliana (Botrytis cinerea) isolates from French vineyards. Crop Prot 18: 687–697 (1999).
5. Myresiotis CK, Karaoglanidis GS and Tzavella-Klonari K, Resistance of Botrytis cinerea isolates from vegetable crops to anilinopyrimidine, phenylpyrrole, hydroxyanilide, benzimidazole, and dicarboximide fungicides. Plant Dis 91: 407-413 (2007).
6. Stammler G and Speakman J, Microtiter Method to Test the Sensitivity of Botrytis cinerea to Boscalid. Journal of Phytopathol 154: 508–510 (2006).